肿瘤学诊断方法之细胞DNA图像定量分析综述
Alfred B?cking 教授
张宇 校译
细胞DNA图像定量分析是一种早期诊断癌细胞的方法，它通过对显微镜下成百上千个送检细胞的遗传物质（DNA）的含量进行测量，在生物学水平对异倍体（Aneuploid）状态的染色体进行判断，从而确定恶性肿瘤的方法。越是恶性的肿瘤，其细胞里染色体的数量与正常细胞相比，就越有较大的偏差。由于染色体主要由DNA组成，所以对于染色体数量的改变（即异倍体），人们可以通过测量每一细胞中DNA含量来确定（即细胞DNA定量分析），可以说，异倍体是恶性肿瘤细胞的标志。通过数码显微镜对DNA含量进行测量，更具有诊断上的说服力，与目前其他诊断方法比，也更具有可重复性。
下面我们将借助于鳞状上皮细胞（Squamous Epithelium）的发育来对细胞DNA图像定量分析在诊断上的应用进行详细的介绍。
细胞DNA图像定量分析检测鳞状上皮细胞（Squamous Epithelium）
不典型增生的上皮细胞是伴随性的癌变前兆（Facultative Precancerous），但是它不能作为癌症的判断标准。癌症发展的风险在病患个体内是不可预测的。对常规染色后的细胞标本进行细胞DNA图像定量分析，可等价为对恶性病变过程当中的染色体异倍化做定量分析。这样对恶性变化的预测准确性可达90%以上。可以说，细胞DNA图像定量分析具有诊断上的高效性，同时又具有低成本性。
材料
细胞DNA图像定量分析适用于子宫颈黏膜、外阴黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜、喉黏膜或者支气管黏膜等器官黏膜标本检测。在切片上圈出发育异常的细胞，用混合二甲苯（Xylol）涂抹覆盖后在固着剂设备中固定。对于活检或脱水样本，可用酶消化发育异常区域的细胞，提取，从而进行定量分析测量[1]。
DNA染色
用副品红（Pararosaniline）或硫堇（Thionin）按照R. Feulgen和Rossenbeck提出的方法对细胞核DNA进行定量的染色是必要的。目前有专用的染色机可以进行染色操作。按照Feulgen方法染色的切片还可以进行退色操作，以便其还可进行传统显微镜下的观测。
DNA测量
只需对传统显微镜配备一块干涉滤镜和一个数码摄像头，我们便可借助基于计算机系统的图像分析程序对细胞核积分光学密度（IOD）成功的做测量。在切片上的样本区域，随机选取并测量至少300个细胞核。这个测量过程是由计算机程序自动完成的。此外还要选取约30个指示细胞。这些指示细胞应该是在细胞形态学上呈二倍体状态（Diploid）的细胞，如正常的中间细胞(Intermediate Cell)或淋巴细胞（Lymphocyte)。
诊断标准
通过对DNA直方图的阐释可以定性的对DNA进行二倍体（Diploid），多倍体（Polyploid）和异倍体（Aneuploid）的归类。一个多倍体的DNA直方图表示这个样本已有乳头状瘤病毒感染（Infection of Human Papillomavirus）[4]。可通过乳头状瘤病毒检测做进一步的分析。而对于肿瘤恶化程度的等级划分，只对不典型增生的细胞进行异倍体定量分析，通常是不可行的。因为受正常细胞的干扰，等级划分结果会产生错误。只有对形态学上具有唯一特征的肿瘤细胞同时做测量，才可以正确划分恶性等级。
诊断上的结果
子宫颈
良性的或处于生命周期中的鳞状上皮细胞是不会有异倍体存在的[5，6，7]。如果存在异倍体，则有98%到100%的可能性在鳞状上皮存在癌灶[5，6，8]。Fu[9]等人也首次揭示，所有接受检查的，日后扩散形成鳞状上皮癌灶的子宫颈不典型增生的部位，其细胞DNA都成异倍体分布。我们观测到，对于有子宫颈病变的37个病例，在细胞学上这些病例DNA异倍体的编组为IIID的，其中30个病例在日后（平均为21个月）的组织学检测中，在相同位置上均发现了癌变[6]。
这表明，细胞DNA定量分析对于发现鳞状上皮癌灶的阳性预测值的准确率为81%。阴性预测值为86%。Nenning等人[10]在他们的研究中也发现，193例怀疑有处于第IIID组的子宫颈癌病患中，也有相似的阳性预测值（87%）和阴性预测值（89%）。在一个90例子宫颈涂片的研究中，所有应用细胞病理学发现的HPV感染（表征为DNA含量>9c）日后都被证实（平均26个月）存在鳞状上皮细胞癌灶。在这项研究中，阳性预测值的准确率为100%，阴性预测值为83%[11]。
而另一项由Bollmann和B?cking主持的，对497个在细胞病理学上编组为IIID的子宫颈涂片的研究表明，通过DNA异倍体（DNA- Aneuploidy）分析的阳性预测值为95%，同时，通过DNA倍体(DNA- Euploidy)分析的阴性预测值为98%。DNA异倍体表现的越明显，则事后通过病理诊断证实在原区域内有癌灶的风险也越大。如果只发现单个异倍体细胞，则3个月后通过病理分析会有41%的病患发现了癌灶；如果全样本内都是异倍体细胞，则病患在3个月后会100%的被诊断有癌灶[17]。
喉
在我们送检的材料（15例）中，通过DNA异倍体对喉黏膜不典型增生的细胞分析得到的阳性预测值为100%[13]。Munck-Wikland等人 [4] 和Bjelenkrantz等人[15]也观测到了同样的结果。
支气管黏膜
通过对送检的28例痰液中不典型增生的上皮细胞做DNA异倍体分析，得到支气管癌的阳性预测值为89.5%[16]。
口腔粘膜
对口腔粘膜的白斑（Leukoplakia）和红斑（Erythroplakia）取样进行DNA定量分析，可使口腔癌诊断的灵敏度（Sensitivity）从91.3%提升到97.8%，特异度（Specificity）从97.4%提升到100%。这可以确保开刀活检获取组织样本的准确性。从而可使29.4%的口腔癌患者在Tis或T1癌症早期就被发现，加大了可治愈的概率。其他一些研究人员[19]用一些复合方法也报道了相似高的准确性。值得一提的还有，多例口腔癌患者，通过DNA定量分析诊断出的时间要比通过组织活检诊断出的时间早两年半[18，19，20]，从而抓住了早期治疗的良期。
适应征
在诊断上，细胞DNA图像定量分析适用于上皮组织不典型增生（局部）位置的确定——即便此时只存在较少的DNA含量异常的细胞。非正常的上皮细胞，其DNA含量变化在传统显微镜下不易观测到，可用细胞DNA图像定量分析进行检测。在子宫颈细胞学领域，本文提及了编组III和编组IIID等列入了Münchner Nomenklatur II中的专业词汇。对于组IVa/b和组V，当采用宫颈锥形切除（Conization）或活检也不能证明患癌时，细胞DNA定量分析则可借助细胞学领域的知识来做出判断。对不典型增生的上皮细胞进行DNA异倍体的分析，可成为用于癌前的早期检测手段，以及患癌后预测恶化趋势的有效方法。而且，细胞DNA定量分析还可以为基于病理检查的癌灶摘除手术，提供指示性的参考。最后，在妇科领域，细胞DNA定量分析更可成为阳性肿瘤细胞诊断的质量控制手段。
作者： Alfred B?cking 教授
德国杜塞尔多夫大学病理系
Roonstra?e 30, 52351 Düren
E-Mail: boecking@uni-duesseldorf.de
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